食品中細菌總數的檢驗實驗步驟及注意事項
一、實驗目的要求
1、瞭解細菌總數檢驗的意義。
2、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數計數的方法3、掌握國標法測定菌落總數的方法和技能4、熟練無菌操作技術。
二、原理
菌落總數是指食品經過處理，在一定條件下培養後，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數。菌落總數主要作為判別食品被污染程度的標誌，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態，以便對被檢樣品進行衞生學評價時提供依據。
菌落總數並不表示樣品中實際存在的所有細菌總數，菌落總數並不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。
三、試劑和儀器
（一）最先準備的器材（清洗、烘乾、包紮、滅菌）
規格名稱
1、500ml廣口瓶2、500ml三角瓶3、250ml三角瓶4、18×180mm試管數量1個1個2個3支
用途:稀釋樣品
配製:生理鹽水
配製:營養瓊脂稀釋樣品倒營養平板
5、1ml移液管5支
6、直徑為90mm平皿10套
7、250ml量筒1支
8、玻璃珠：直徑約5mm
（二）應滅菌、消毒的器材
剪刀1把不鏽鋼藥匙1把稱量紙：適量酒精消毒的器材：吸耳球1個，滴管膠頭4只，開瓶器
（三）應制備的培養基
培養基總量所用容器
1、0.85%NaCl生理鹽水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶2、平板計數瓊脂（PCA）培養基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶四、實驗內容
（一）、基本操作過程：
樣品稱量→→樣品稀釋→→傾注平皿→→培養48小時→→計數報告。（二）、樣品的稀釋（樣品的處理）
樣品：袋裝乳粉
外包裝消毒→→無菌稱樣品25g→→加無菌生理鹽水→→加蓋振盪搖均勻
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用無菌剪刀開封取樣。稱取檢樣25g，放入裝有適量玻璃珠的滅菌廣口瓶子中，然後用225mL温熱的滅菌生理鹽水徐徐加入（先加入少量生理鹽水將乳粉調成糊狀，再全部加入，以免奶粉結團），採用振搖法（用力快速振搖50次,振幅不小於40cm）振搖均勻，即為1:10的稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液後，最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min，製成1：10的均勻稀釋液。
2、用1ml滅菌吸管，吸取1∶10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管混合均勻，製成1∶100稀釋液。
3、另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管。
4、根據對檢樣污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的稀釋液1ml於滅菌平皿內，每個稀釋度做2個平皿。
5、用1ml生理鹽水作空白對照試驗，做2個平皿。?注意：
①吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內稀釋液。
②吸管插入檢樣液內取樣稀釋時，插入深度要達2.5cm以上,調整時應使管尖與容器內壁緊貼。
③進行稀釋時，應使吸管內的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。
④每遞增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。（三）、倒平板
稀釋液移入平皿後，應及時將涼至46℃的營養瓊脂培養基（放置於46℃水浴保温）傾注入平皿約15ml，並轉動平皿使混合均勻。
注意：
①培養基不能觸及平皿口邊沿，加入培養基後可正反兩個方向旋轉，但不可用力過度，以免濺起觸及上蓋。
②檢樣從開始稀釋到傾注最後一個平皿，所用時間不宜超過20min。
（四）、培養
待瓊膠凝固後，翻轉平皿，置36±1℃温箱內培養48h後取出，立即計算平皿內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。
注意：
（1）瓊脂凝固後，就立即將平板放入培養箱內進行培養，以免細菌蔓延生長。
（2）
如果把不能立即計數，要將平板放入0～4℃冰箱中，但不能超過24h。
不同產品菌落總數測定的培養時間：
肉、乳、蛋及製品：37℃培養48h水產品：30℃培養48h：清涼飲料、調味品、糕點、果脯、酒類等：37℃培養24h五、結果報告
1、平皿菌落數的選擇
（1）選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數測定標準。每一個稀釋度應採用兩個平皿，大於300的可記為多不可計。
（2）其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜採用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分佈又很均勻，則可以計算半個平板後乘以2，以代表一個平板的菌落數。
（3）當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。2、菌落總數的計算
（1）若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）中菌落總數結果。
（2）若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時，按如下公式計算：N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)式中：N―樣品中菌落數；∑C―平板（含適宜範圍菌落數的平板）菌落數之和；nl―第一個適宜稀釋度平板數；n2―第二個適宜稀釋度平板數；d―稀釋因子（第一稀釋度）。
（3）若所有稀釋度的平板菌落數均>300，則取最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
（4）若所有稀釋度平板菌落數均<30，則以最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍數計算。（5）若所有稀釋度平板均無菌落生長，則應按<1乘以最低稀釋倍數計算。
（6）若所有稀釋度均不在30～300之間，有的>300，有的又<30，則應以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
3、報告方法
（1）菌落數在1～100時，按四捨五入報告兩位有效數字。
（2）菌落數≥100時，第三位數字按四捨五入計算，取前面兩位有效數字，為了縮短數字後面的零數，也可以10的.指數表示。
（3）若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。
（4）若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。
（5）稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。
四、實驗內容
（一）、基本操作過程：
樣品稱量→→樣品的稀釋→→傾注平皿→→培養5天→→計數報告。（二）、樣品的稀釋（樣品的處理）
樣品：糖果
用滅菌鑷子夾取包裝紙,稱取數塊共25g，加入預温至45℃的滅菌水225mL，待溶化後檢驗。
1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，以無菌操作開封取樣。稱取檢樣25g，放入裝有適量玻璃珠的滅菌廣口瓶子中。然後加入225mL的滅菌水，採用振搖法（用力快速振搖50次,振幅不小於40cm）振搖30min，振搖均勻，即為1:10的稀釋液。
2、用10ml滅菌吸管，吸取1∶10稀釋液10ml，注入無菌試管內，另用帶橡皮乳頭的1ml滅菌吸管反覆吹吸50次，使黴菌孢子充分散開。
3、用1ml滅菌吸管，吸取上述1∶10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌水的試管內，換一支1ml滅菌吸管反覆吹吸5次，製成1∶100稀釋液。
4、另取1ml滅菌吸管，吸取上述1∶100稀釋液1ml，注入含有9ml滅水的試管內，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管。
5、根據對檢樣污染的情況估計，選擇3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同
時，即以吸取該稀釋度的1ml稀釋液於滅菌平皿內，每個稀釋度做2個平皿。
6、用1ml無菌水作空白對照試驗，做2個平皿。?注意：
①加入檢樣液時，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內稀釋液，並將吸管內的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。
②吸管插入檢樣液內取樣稀釋時，插入深度要達2.5cm以上,調整時應使管尖與容器內緊貼。
③每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管。（三）、倒平板
稀釋液移入平皿後，及時將涼至46℃的培養基（可放置於46℃水浴保温）傾注入平皿約15ml，並正反轉動平皿使混合均勻。?注意：
①培養基不能觸及平皿口邊沿，加入培養基後可正反兩個方向旋轉，但不可用力過度，以免濺起觸及上蓋。
②檢樣從開始稀釋到傾注最後一個平皿，所用時間不宜過長。（四）、培養：
待瓊脂凝固後，翻轉平皿，置25～28℃温箱內培養5天，從第3天開始觀察後取出，共觀察培養5天。五、菌落計數及報告：
選取菌落數在10CFU～150CFU的平板，根據菌落形態分別計數黴菌和酵母數。黴菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數應採用兩個平板的平均數。
1）計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數計算。
2）若所有平板上菌落數均大於150CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
3）若所有平板上菌落數均小於10CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
4）若所有稀釋度平板均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數計算；如為原液，則以小於1計數。
五、結果報告
