獸醫微生物的實習報告

一．實習目的

為了使學生能夠理論聯繫實際，通過親自實地解剖感染小鼠，對小鼠的心、肝、脾進行麥康凱瓊脂平板劃線培養，以柯赫法則為這次實習的主線，達到鑑定出小鼠感染的菌種的目的，熟練運用微生物實驗課的所涉及的實驗操作和方法，提高實驗動手能力，分析實驗過程中可能出現的問題，並解決問題。特開設微生物教學實習，掌握基本技能，加深理論部分的理解，能夠獨立診斷出傳染病病菌，獲得嚴謹的科學實驗素養。

二．實習材料

實驗動物：一隻被感染小鼠，一隻健康小鼠

實驗器械，主要包括：小鼠解剖工具手術剪、鑷子、蠟盤、釘子，接種棒、酒精燈、打火機、記號筆、手套、載玻片、槍頭、注射器、離心管。

實驗材料：麥康凱瓊脂平板、各種染色液（結晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黃水）、蒸餾水、培養基（普通肉湯培養基、蛋白腖培養基、葡萄糖蛋白腖培養基、固體培養基）、PBS重懸液、生化試驗材料（微量發酵管（葡、乳、枸、尿素、麥、甘醇、蔗、硫）、對二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基紅、vp甲乙液）。

實驗主要儀器：離心機，分光光度器，温箱，搖牀，超淨工作台

三．實習內容

以柯赫法則為主線，通過對感染小鼠的剖解採樣、分離培養、鏡檢、擴增培養，然後把得到的純培養物對健康小鼠進行再次接種以獲得被感染小鼠，再次重複以上操作，把獲得的純培養物通過鏡檢觀察和做生化實驗來鑑定出感染小鼠的致病菌。

四．實習操作進程

第一天：實驗設計、討論症狀、分離剖解

1 實驗設計：以小組為單位進行實驗設計，明確此次實驗主要法則是：柯赫法則。在老師的指導下確定此次實習的主要步驟，討論實驗中可能遇到的問題以及注意事項。

2 討論症狀：比較觀察健康小鼠與病鼠，可見到病鼠一般呈萎靡狀，不活躍。每組領取一隻感染小鼠觀察症狀，體表基本正常。

3 分離剖解：先將麥康凱瓊脂平板分三區，依次寫上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，將小鼠搖暈，採用頸椎脱臼法將小鼠處死。將小鼠屍體仰卧固定於蠟盤上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔軟部用剪刀剪一小口，然後從該小口處往上、往下剪將皮毛剝離，剝離腹膜暴露出肝臟和脾，可觀察到有輕微的肝腫脹，顏色變淡。將肝和脾切開一小口，用接種環取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應區域進行劃線分離。再打開胸腔觀察，可見胸腔有出血現象和凝血塊，剪開心包膜，將心臟切一小口，用接種環取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應區域進行劃線分離。寫上班級組別，日期，置於温箱中培養至第二天早上8點。

第二天：挑取單菌落，鏡檢，擴增培養，重懸，測OD配濃度，小鼠腹腔注射

1 挑取單菌落：觀察麥康凱瓊脂平板上菌落的形態為圓形，邊緣整齊，表面光滑，暗紅色，圓心處顏色較邊緣淺。挑去單個菌落，畫上記號準備做後續試驗。

2 鏡檢：選取所挑選菌落的.一半進行抹片。取乾淨玻片，滴半滴去離子水，用接種環挑取菌進行抹片、乾燥固定、採用格蘭染色法染色：草酸銨結晶紫染色1-2’，水洗，革蘭氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脱色約30’’-1’，水洗，沙黃水溶液復染10 ’ ’-30 ’ ’，水洗。吸乾，鏡檢。觀察到該菌被染成紅色，是格蘭陰性菌。

3 擴增培養：選取剩餘的菌接種到肉湯培養基中，置於温箱培養9個小時至菌的生長對數期。

4 重懸測OD值配濃度：下午5點左右，將培養的菌轉入無菌小管中離心，離心後可見菌沉於管底，在超淨工作台內操作，去上清液，用槍頭吸取PBS液至去了上清液的菌管中，反覆吹打使其重懸，然後再次離心，去上清，重懸，通過分光光度計測得OD590的值，配成2*10^7CFU濃度的菌液。

5 小鼠腹腔注射：每組挑選一隻健康小鼠，在頭部或尾部做上記號，用右手抓住鼠尾，將其搖暈，令其前爪抓住鐵絲蓋上，然後用左手的拇指和食指捏住小鼠頭頸部皮膚，並翻轉左後使其腹部朝上，將其尾巴夾在左手掌與小指之間，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股後側面插入針頭，先刺入皮下，後進入腹腔，注射時阻力，皮膚也無泡隆起。注射完將小鼠放回鼠籠即可。

第三天：觀察小鼠發病情況

小組成員分時間段觀察小鼠感染情況，見小鼠瀕死的儘快解剖接種分離致病菌。若 一整天未見小鼠有異常情況的等第二天解剖

第四天：剖解劃線培養

雖然小鼠未見萎靡，由於預訂的感染時間差不多，可以進行解剖接種第一天的操作，

可見體表有淤血點，剖開的小鼠肝臟流出大量的血液。其餘均同第一天的操作，將麥康凱瓊脂平板的上所接的菌置於温箱中培養。

第五天：生化鑑定

觀察到平板上只有一個較小的暗紅色菌落，挑取該菌落進行擴增培養9小時至細菌生長的對數期。下午6點觀察，培養液依舊是澄清的，很可能沒有長菌。為做進一步的驗證，進行生化試驗。將該菌接入微量發酵管（）和蛋白腖以及葡萄糖蛋白腖中，培養至第二天看結果。

第六天：觀察結果，整理報告

生化試驗無任何反應，説明接的菌為雜菌或污物，整理實驗報告並分析失敗原因。

六．實驗結果與分析

此次試驗失敗

給小鼠攻毒，未能分離出致病菌，因此也無法鑑定出小鼠被感染的病原菌為何種腸桿菌科

試驗失敗原因可能有：

1、接種棒火焰消毒後，等待冷卻的時間過短，接種棒接種菌時將菌燙死

2、由於小鼠的免疫力強，使得感染小鼠的病原菌被免疫掉了，因此未接種到治病菌

3.給小鼠注射的量或濃度還不夠未能達到使小鼠感染的目的

4、在第一次從小鼠體內分離出來的菌可能不是致病菌，或者麥康凱瓊脂平板上培養出來的 菌落不止一種，而我們挑選到的某一菌落恰好不是致病菌。

5、在進行腹腔注射時，可能沒有注射到腹腔，而只注射到皮下，或者其它部位。

6、採樣時可能由於接種環未完全伸入到心、肝、脾的組織中，或者伸到的組織裏 恰好沒有致病菌

7、可能由於小鼠感染的時間過短，還未達到菌生長曲線的高峯期

七．思考與總結

1 此次試驗失敗的原因有很多在我看來最有可能的原因有以下幾點：

（1） 小鼠免疫:由於這些小鼠是實驗室的小鼠，長期被用來做各種致病菌的實驗，使得它們獲得一定的免疫，所以雖然注射了足夠使小鼠感染髮病的劑量，但也被小鼠免疫掉了，而無法從小鼠體內獲得病料。

（2） 病料不夠：從學姐那瞭解到，她們做攻毒實驗的動物，都是將整個組織塊磨碎以後，再接到培養基上，而我們做實驗是隻是用接種棒挑取一點，接種棒上粘到的病料比較少或根本沒有，因此培養不出菌。

（3） 挑取的單菌落未必是致病菌：由於平板上長出可能不止一種菌，因此挑到的單菌落，未必是致病菌。

2為什麼擴增出來的菌不直接注射小鼠，而要經過離心？

因為菌可能會產生毒素，若直接注射可能就無法判斷使小鼠發病的到底是毒素作用，還是因為病菌在小鼠體內繁殖感染而造成的。

3 腸桿菌科有哪些，特徵有哪些？

學生自我鑑定：

2011年5月16號到21號期間進行了維持一週的微生物實習，在微生物實習期間，我能夠做到主動和小組成員交流、合作、解決問題，認真完成實驗操作，學會靈活運用自己的專業知識解決問題。

通過這段時期的實習，我們對無菌操作有了進一步的理解，掌握了儀器操作的基本技能，鞏固了理論部分的知識，也瞭解到公共衞生意識的重要性。

實習不過短短的五天，在這短暫的五天內，，我們有過發現時的喜悦，有過解剖小鼠時的緊張，有過培養不出菌時的困惑，但最終我們收穫了知識，也收穫了友誼，在合作中共同進步，在困難中共同進退，一切的困難便能迎刃而解。

這次微生物實習為我們專業的繼續拓展提供了寶貴的經驗，為動物醫學本科專業的我們學習後續課程奠定紮實的基矗