蛋白質化學試題及答案

蛋白質化學作業

一：名詞解釋：

等電點：在某一種特定PH的溶液中，某物質以兩性離子形式存在，所帶的正負電荷總數相等，靜電荷數為零，在電場中它即不向正極移動也不向負極移動，此時的PH值為該物質的等電點。

鹽析和鹽溶：蛋白質溶液中加入中性鹽後，因鹽的濃度不同可產生不同的反應。低鹽濃度時，隨鹽濃度的增加，蛋白質溶解度增加的現象，稱為鹽溶。而高濃度中性鹽可使蛋白質分子脱水並中和其電荷，從而使蛋白質從溶液中沉澱出來，稱為鹽析。

蛋白質變性：天然蛋白質分子由於受到物理或化學因素的影響使次級鍵斷裂，引起天然構象的改變，導致其生物活性的喪失及一些理化性質的改變，但未引起肽鍵的斷裂，這種現象稱為蛋白質的變性。

結合蛋白：由簡單蛋白質即只有氨基酸成分的蛋白質與非蛋白質組分結合而成，其非蛋白質組分通常稱為輔基。

蛋白質亞基：是組成蛋白質四級結構最小的共價單位。在具有四級機構的蛋白質中有三級機構的球蛋白稱為亞基。它可由一條肽鏈組成，也可由幾條肽鏈通過二硫鍵和次級鍵連接在一起組成。

酰胺平面：肽鍵中C-N具有雙鍵的性質，因而C-N不能自由旋轉，這樣使得與它相連的原子都固定在一個平面，這個平面就稱為酰胺平面。

誘導契合：酶分子活性中心的結構原來並非和底物的結構互相吻合，但酶的活性中心是親性的而非剛性的，當底物與酶相遇時，可誘導酶活性中心的構象發生相應的變化，其上有關的各個集團達到正確的排列和定向，因而使酶和底物契合而結合成中間絡合物，並引起底物發生反應。反應結束當產物從原酶上脱落下來後，酶的活性中心有恢復了原來的構象。

二：判斷題：

2題對，其餘錯

三：填空題：

1. 色氨酸、酪氨酸

2. ①二硫鍵②疏水鍵③範得華力

3. ①協同 ②變構

4. ①α--氨基②α-羧基③側鏈可解離基團

四：選擇題：

（1）：1； （2）：3； （3）：2

五：問答題：

1， 什麼叫蛋白質的一級、二級、三級、四級結構？維持以上各層次結構的作用力有哪些？

蛋白質一級結構：由氨基酸在多肽鏈中的數目、類型和順序所描述的多肽鏈的基本結構。它排除了氨基酸a-碳原子的構型以外的原子空間排列，同樣也排除了二硫鍵，所以不等於分子的共價結構。維繫的作用力氨基和羧基縮合形成的共價鍵。

蛋白質二級結構：多肽鏈主鏈在以及結構的基礎上進一步的盤旋或摺疊，從而形成有規律的構象，如a-螺旋、β-摺疊、β-轉角、無規捲曲等，這些結構又稱為主鏈構象的結構單元。維繫的作用力是氫鍵。二級結構不涉及氨基酸殘疾的側鏈構象。

蛋白質三級結構：指一條多肽鏈在二級結構（超二級結構及結構域）的基礎上，進一步地盤繞、摺疊，從而產生特定的空間結構或者説三級結構是指多肽鏈中所有原子的空間排布。維繫作用力有疏水作用力、氫鍵、範德華力、鹽鍵（靜電作用力），另外二硫鍵在某些蛋白質中也起非常重要的作用。

蛋白質四級結構：有許多蛋白質有兩個或兩個以上的具有獨立三級結構的亞基通過一些非共價鍵結合成為多聚體，這些亞基的結構是可以相同的，也可以是不同的。四級結構指亞基的種類數目及各個亞基在寡聚蛋白中的空間排布和亞基之間的相互作用。維繫作用力有疏水作用力、氫鍵、範德華力、鹽鍵（靜電作用力）。

2, 蛋白質溶液作為親水膠體，其穩定因素有哪些？它們是怎樣起穩定作用的？

①蛋白質分子小(直徑在1?100nm之間)。介質(水)分子的布朗運動對蛋白質分子(因小)碰撞的合力不等於零，因此它具有動力學上的穩定性；

②蛋白質分子攜帶同種電荷。一種蛋白質在一定的pH環境下(等電pH除外)帶有同種電荷,因相互排斥而不易聚集沉澱；

③球狀蛋白質分子表面具有親水基團。它們使蛋白質分子表面形成水化層。因而阻礙分子相互靠攏。（5分）

3, 什麼是蛋白質的變性作用？引起蛋白質變性的因素有哪些？

蛋白質的變性作用，是指蛋白質立體結構被破壞，使按特定方式摺疊捲曲的多肽鏈由有序狀態成為伸展鬆散的無規則排列狀態，變性一般不涉及肽鍵的斷裂，而主要是次級鍵斷裂，破壞了維持蛋白質立體結構條件，使蛋白質構象被破壞。（2分）變性後的蛋白質，溶解度降低，粘度增加，失去活性，失去結晶能力，易於被酶水解。

引起蛋白質變性的因素有兩大類：

①物理因素：加熱變性使蛋白質沉澱、紫外光、X-射線、超聲波、高壓?； ②化學因素：

A: 有機溶劑：丙酮、乙醇等有機溶劑有較強的親水能力，能破壞蛋白質分子周圍的水化層，導致蛋白質沉澱析出。

B:重金屬鹽：Hg2+ 、 Ag+ 、Pb2+等重金屬離子可與蛋白質中帶負電荷的集團形成不易溶解而沉澱。

C:生物鹼試劑：可與蛋白質中帶正電荷的集團形成不溶性鹽析出。

其中 強酸、強鹼、脲、去垢劑、重金屬鹽、生物鹼試劑及有機溶劑等化學因素可引起蛋白質變性。

4, 蛋白質有哪些重要的理化性質？分別舉例説明這些重要性質在輕工業中的應用。

1）蛋白質的兩性電離及等電點：蛋白質兩端的氨基和羧基及側鏈中的某些基團，在一定的溶液PH條件下可解離成負電荷或正電荷的基團。如等電聚焦電泳分離蛋白質。

2）蛋白質的沉澱：在適當的條件下，蛋白質從溶液中析出的現象如：丙酮沉澱，破壞水化層。也可用乙醇。鹽析，將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，破壞在水溶液中的穩定因素電荷而沉澱。如搶救誤服重金屬鹽中毒的病人。

3）蛋白質變性與復性：在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，從而導致其理化性子的改變和生物活性的喪失，主要為二硫鍵和非共價鍵的破壞，不涉及一級結構的改變。變性後，其溶解度降低，粘度增加，結晶能力消失，生物活性喪失，易被蛋白酶水解。如工業上消毒殺菌及蛋白質的分析分離。

4）蛋白質的紫外吸收：由於蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm處有特徵性吸收峯，可用蛋白質含量測定。

5）蛋白質的呈色反應：對生物材料中蛋白質含量測定。

茚三酮反應：經水解後產生的氨基酸，其氨基與茚三酮水合物反應可生成藍紫色化合物，此化合物最大吸收峯在570nm波長處。

雙縮脲反應：蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀鹼溶液中與硫酸銅共熱，呈紫色或紅色。氨基酸不出現此反應。蛋白質水解加強，氨基酸濃度升高，雙縮脲呈色深度下降，可檢測蛋白質水解程度。

5, 舉例説明“蛋白質在生活細胞中含量豐富，功能繁多，是生命活動的體現者。”

1）酶是以蛋白質為主要成分的生物催化劑，代謝反應幾乎都是在酶的催化作用下進行的。

2）結構蛋白參與細胞和組織的建成

3）某些動物激素是蛋白質，如胰島素、促甲狀腺激素等，在代謝調節中具有十分重要的作用

4）運動蛋白如肌肉中的肌動蛋白，肌球蛋白等與肌肉收縮和細胞運動有關

5）高等動物的抗體、補體、干擾素等蛋白質具有防禦功能

6）某些蛋白質具有運輸功能，如血紅蛋白和肌紅蛋白運輸氧，脂蛋白運輸脂累、細胞色素和鐵氧還原蛋白傳遞電子等

7）激素和神經質的受體蛋白有接受和傳遞信息的功能，如細胞表面抗原參與免疫反應和細胞識別

8）染色質蛋白、阻遏蛋白轉錄因子等參與基因表達的調控，細胞週期蛋白等具有調控細胞分裂、增值、生長、分化的功能

9）貯藏蛋白、卵有蛋白等具有貯藏氨基酸和蛋白質的功能。

如此看來，蛋白質在生活細胞中含量豐富，功能繁多，是生命活動的體現者。 (以上舉例其中3項即可)

6, 簡述sephadex-25凝膠層析的原理。

凝膠層析又稱凝膠過濾，是種按分子量大小分離物質的層析方法。該方法是把樣品加到充滿着凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩衝溶液洗脱，大分子無法進入凝膠顆粒的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能夠自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相中達到動態平衡，所以要花費很長時間流經柱牀，使得不同大小的分子得以分離。

四：實驗題：

1，有一種由溶菌酶和血清白蛋白組成的混合樣品，已知溶菌酶的分子量是13930，pI=11，血清白蛋白分子量是68500，pI=4.8寫出將他們分離的兩種方法（要求只寫出分離原理）。

1）凝膠層析法：將樣品加加到充滿着凝膠顆粒的層析柱中，然後用緩衝溶液洗脱，大分子無法進入凝膠顆粒的靜止相中，只能存在於凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能夠自由出入凝膠顆粒中，並很快在流動相和靜止相中達到動態平衡，所以要花費很長時間流經柱牀，使得不同大小的分子得以分離。

2）電泳法：把溶液調到中性，因溶菌酶和血清蛋白兩個等電點各不相同，使得混合液中溶菌酶和血清蛋白帶上正負不同的電荷，利用電泳法使它們分離到正負不同的兩級而達到分離的目的。

2，有兩種二肽化合物Gly-Ala和Lys-Ala，現將他們在pH=8的緩衝液中進行電泳，請畫出這兩種二肽在電場中的泳動方向。

Gly-Ala的等電點PIPH=8 帶正電荷 如圖示：

思考題：

在體外，用下列方法處理，對血紅蛋白與氧的親和力有什麼影響？

①pH從7.0增加到7.4；

②CO2分壓從10torr增加到40torr；

③O2分壓從60torr下降到20torr；

④2，3-二磷酸甘油酸(DPG)的濃度從8×10-4mol/L下降到2×10-4mol/L； ⑤α2β2解聚成單個亞基

①pH增加，Hb與氧的親和力增加。（1分）

②CO2分壓增加，Hb與氧的親和力下降。（1分）

③O2分壓下降，Hb與氧的親和力下降。（1分）

④DPG濃度下降，Hb與氧的親和力提高。（1分）

⑤α2β2解聚成單個亞基，與氧的親和力提高。（1分）

2.血紅蛋白(Hb)是由兩個α-亞基和兩個β-亞基組成的四聚體，它的α-和β-亞基的三級結構類似於肌紅蛋白(Mb)。但是Mb中許多親水殘基在Hb中卻被疏水殘基取代。

問:(1)這種現象怎樣與疏水殘基應摺疊到分子內部的原則相一致？

(2)在維持Hb四級結構的作用力方面，你能得出什麼結論？

①疏水側鏈在血紅蛋白亞基表面的某些區域形成疏水面，這樣α-亞基和β-亞基能相互緊密的結合在一起形成一定的空間結構。它們的疏水側鏈雖然分佈在血紅蛋白亞基的表面，但就整個血紅蛋白分子來看，依然是在血紅蛋白分子的內部。（4分）

②疏水作用是維持血紅蛋白四級結構的主要作用力。（1分）

選擇題

1．在生理條件下，下列哪種基團既可作H+的受體，也可作H+的供體。A

A His的咪唑基B Lys的ε－氨基

C Arg的胍基 D Cys的巰基

2．下列哪種氨基酸最易出現在β—轉角 B

A Ala B Gly C Leu D Arg

3．在凝膠過濾中，下列哪種分子最先被洗脱下來B

A蛋白A，MW=17，000 B蛋白B，MW=50，000

C蛋白C，MW=10，000D蛋白D，MW=5，000

4．在蛋白質序列研究中，拆開的二硫鍵用下列哪種試劑保護A

Aβ-巰基乙醇 B碘乙酸 C過碘酸 D 二硫蘇糖醇

5．下列哪種情況最可能形成β-摺疊 B

A poly Pro B Ala – Val – Ala – Val – Ala – Val

C poly Gly D Gly – Ser –Gly – Ser –Gly – Ser

6.蛋白質分子組成中不含有下列哪種氨基酸?E

A.半胱氨酸B.蛋氨酸

C.胱氨酸 D.絲氨酸 E.瓜氨酸

7. 胰蛋白酶專一水解多肽鍵中（ ）C

A 鹼性殘基N端；B酸性殘基N端；C鹼性殘基C端；D酸性殘基C端

8.溴化氰(CNBr)作用於()_A

A. 甲硫氨酰-X B. 精氨酰-X C. X-色氨酸

D. X-組氨酸

9.穀氨酸的pK值為2.19，4.25，9.76；賴氨酸的pK值為2.18，8.95，10.53；

則它們的PI值分別為()B

A.4.25和8.95 B.3.22和9.74C.6.96和5.56

D.5.93和6.36 E.2.19和10.53

10、從賴氨酸中分離出穀氨酸的可能性最小的方法是( )A

A. 紙層析B. 陽離子交換層析 C. 陰離子交換層析D. 葡萄糖凝膠過濾 E. 電泳

11、__________用於確定多肽中C-末端氨基酸D

A Sanger試劑 B Edman試劑 C 兩者均可 D 兩者均不可

12、為從組織提取液中沉澱出活性蛋白最有可能的`方法是加入()A

A. 硫酸銨B 三氯乙酸C 對氯汞苯甲酸 D 氯化汞

13、__________是一種去垢劑，常用在凝膠過濾中，以測定蛋白質的分子量D

A β-巰基乙醇 B鹽酸胍C碘乙酸 D十二烷基磺酸鈉

14. 肽Asp-Arg-Cys-Lys-Tyr-Ile-Gly用胰蛋白酶(T)和胰凝乳蛋白酶(C)處理,將產生（ ）A

A三個二肽和Tyr B 兩個二肽和一個三肽 C Asp,Cys和一個二肽 D 一個二肽和一個五肽

15.蛋白質變性過程中,伴隨着結構上的變化,其原因是C

a. 肽鍵的斷裂 b. 氨基酸殘基的化學修飾頭物 c. 維繫空間結構的氫鍵斷裂 d. 二硫鍵的打開

16.茚三酮反應是A

a. 和a-氨基酸的專一性反應 b. 測定蛋白質中肽鍵數量的反應c. 測定甘油三脂的反應 d. 測定多糖中糖苷鍵數量的反應

17、雙縮脲反應是_________的特有反應D

a. DNA b. RNA c. 磷酸二酯鍵 d. 肽和蛋白質

18、有一蛋白質水解物,在pH6時,用陽離子交換柱層析,第一個被洗脱的氨基酸是A

a. Val(pI5.96)b. Lys(pI9.74) c. Asp(pI2.77)d. Arg(pI10.76)

e. Tyr(pI5.66)

19．對一個富含HiS殘基的蛋白質在使用離子交換層析時，應優先考慮的是嚴格控制什麼?B

(A)鹽濃度 (B)洗脱液的pH (C)NaCl梯度(D)蛋白質樣品上柱時的濃度

20．每個蛋白質分子必定具有的結構是什麼?C

a．α-螺旋b. β-摺疊c．三級結構 d．四級結構

填空題

1. 穩定蛋白質膠體狀態的因素是蛋白質分子上的________及________.

2. 氫鍵有兩個主要特徵____________和_____________.

3. 兩條相當伸展的肽鏈或同一條肽鏈的兩個伸展的片斷之間形成氫鍵的二級結構稱為_______.

4. 破壞a-螺旋結構的氨基酸是_________和________

5. 測定蛋白質紫外吸收的波長,一般在____________,主要由於蛋白質中, 存在着_______, ______, __________殘基側鏈基團.

6. 蛋白質二級結構和三級結構之間還存在_______和_________兩種組合體

7. 在分析蛋白質多肽鏈的氨基酸序列時,利用胰蛋白酶水解時,可斷定被水解肽鍵的_________端是_________和________;利用胰凝乳蛋白酶水解時可斷定被水解肽鍵的_________端是__________,___________,和___________.

簡答題：

1. 蛋白質化學測序法的原則和程序可歸納為哪5個階段?(僅需寫出階段名稱)

1. 必須氨基酸及其三字母符號

2. 舉出5種重要的氨基酸側鏈功能團(化學結構式,功能團名稱,各歸屬於何種氨基酸)

3. 凝膠層析的基本原理.凝膠層析的主要類型的名稱

4. 蛋白質電泳基本原理及影響電泳速度的主要因素

綜合題

1. 某九肽組成為兩個Gly,兩個Phe,Tyr,Met,Asp,Arg和Pro,經胰凝乳蛋白酶水解得五肽和四肽,四肽組成為Phe,Tyr,Gly和Pro.此九肽的CNBr處理產物經陽離子交換樹脂層析並洗脱得一組成為Arg,Phe和Gly的三肽.此九肽經胰蛋白酶水解得Phe,如用FDNB反應後在水解測得DNP-Tyr.請寫出此九肽順序及解析過程。 分析過程：

（1）由“用FDNB反應後在水解測得DNP-Tyr.”得出該九肽的N末端為Tyr。

（2）因為經胰凝乳蛋白酶水解得五肽和四肽,四肽組成為Phe,Tyr,Gly和Pro. 又因胰凝乳蛋白酶只作用於Phe,Tyr, Trp的羧基形成的肽鍵，並且肽鍵不能作用於Pro的氨基形成的肽鍵。因此可推斷出該四肽組成為Tyr-Pro-Gly-Phe

（3）由“九肽的CNBr處理產物經陽離子交換樹脂層析並洗脱得一組成為Arg,Phe和Gly的三肽.”得出Met，Gly，Arg，Phe組成的四肽，以Met為N末端。

（4）因此九肽經胰蛋白酶水解得Phe,的出Arg-Phe，與（3）綜合得出

Met-Gly-Arg-Phe

（5）由於九肽組成為兩個Gly,兩個Phe,Tyr,Met,Asp,Arg和Pro,因此由（2）（4）綜合後得出該九肽為Tyr-Pro-Gly-Phe- Asp- Met-Gly-Arg-Phe

2. 水解肽A時,發現其含有等量的Arg,Val,Tyr,Glu,Lys,Ala和Gly七種氨基酸

1).用胰蛋白酶水解肽A時,得到如下物質:Arg,Ala-Lys和含有Glu,Gly,Tyr,Val的肽B;用胰凝乳蛋白酶水解肽B,產生兩個二肽:Val-Tyr和Glu-Gly

2)肽A用羧肽酶短時間處理,產生遊離的Glu是第一個可鑑定的氨基酸

3)肽A用DNFB法分析N端氨基酸,產生出DNP-Ala

問該肽A的氨基酸排列順序是怎樣的？

分析：

由（1）推斷出A肽的序列有以下幾種可能：Arg-Ala-Lys-Val-Tyr- Glu-Gly;

Ala-Lys -Arg-Val-Tyr- Glu-Gly; Arg-Ala-Lys-Val-Tyr -Gly- Glu; Ala-Lys -Arg- Val-Tyr -Gly- Glu;

由（2）推斷出A肽的序列可能為Arg-Ala-Lys-Val-Tyr -Gly- Glu或者 Ala-Lys -Arg-Val-Tyr -Gly- Glu;

由（3）推斷出A肽的序列為Ala-Lys -Arg-Val-Tyr -Gly- Glu;

蛋白質化學

1、簡述氨基酸的結構特點及兩性解離特性。

答：

特點：

氨基酸是蛋白質分子的基本組成單位。在20種基本氨基酸中，除脯氨酸α-亞氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其餘L-α-氨基酸；每種氨基酸分子至少有一個氨基和一個羧基；至少有一個氨基和一個羧基鏈接在同一個碳原子上；各種氨基酸之間的區別在於R基團不同。

兩性解離特性：

氨基酸分子在生理pH條件下形成了兼性分子（分子中含有等量的正電荷和負電荷，使該分子的淨電荷為零）。氨基酸分子中除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在不同的pH溶液中可解離成正離子或負離子，因此氨基酸分子即可帶有正電荷又可帶有負電荷，這種性質稱為氨基酸的兩性解離。

2、蛋白質一級結構測定的原理和結果分析。

答：

準備：

樣品必須純（>97%以上）；確定蛋白質中所含的多肽鏈(亞基)的數目；二硫鍵的斷裂；對每種亞基進行分離和純化；確定亞基中氨基酸的組成。

①確定蛋白質分子中多肽鏈的數目，利用具有特異識別位點的蛋白酶將每條多肽鏈酶解成可以直接進行序列測定的短肽片段(包括斷開多肽鏈內的二硫鍵)；

②分離並純化各短肽片段；

③確定每條片段中的氨基酸順序；

④利用不同識別位點的蛋白酶將多肽鏈酶解成不同的短肽片段，重複步驟①-③若干次；

⑤通過比較用不同的蛋白酶切割形成的短肽片段的序列，確定每條多肽鏈中氨基酸的順序

N-端測序

1) Sanger法/DNFB法/二硝基氟苯法

2,4-二硝基氟苯（Sanger試劑）在鹼性條件下，與肽鏈N-端的遊離氨基作用，生成二硝基苯衍生物。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用層析法進行鑑定。

2) 丹磺酰氯（DNS）法

在鹼性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基發生酰基化作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優點是丹磺酰-氨基酸有強烈的熒光基團，檢測靈敏度比DNFB法高100倍。

3) Edman化學降解法/苯異硫氰酸酯/PITC法

首先在pH9.0的鹼性環境下，將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白質或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然後以三氟乙酸(TFA)處理耦合後產物，將多肽或蛋白的N一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨後萃取出釋放的氨基酸衍生物並在強酸性條件下轉化為穩定的乙內酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最後以色譜法鑑定出降解下來的PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質或多肽N端序列信息。從蛋白質或多肽氨基末端進行分析，不斷重複循環，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。

4) 氨肽酶法

氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個水解。依不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而推斷蛋白質的N-末端殘基。 C-端測序

5) 羧肽酶法

羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個水解。依不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而推斷蛋白質的C-末端殘基。

6) 肼解法

多肽與肼在無水條件下加熱，從多肽鏈上解離出C-端氨基酸，剩餘部分變為肼化物，與C-端氨基酸分離。

⑥確定多肽鏈內及多肽鏈間的二硫鍵的位置。

（二硫鍵可以被過甲酸氧化或被硫醇還原而斷裂。

過甲酸氧化可以斷裂所有二硫鍵，但同時氧化Met殘基，並破壞Trp側鏈的吲哚基團。

硫醇（2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘇糖醇）還原性裂解二硫鍵。）

（在測定多肽鏈的氨基酸序列之前，瞭解肽鏈中的氨基酸組成即每種氨基酸殘基存在的數量是十分必要的。） ⑦將肽鏈完全水解以釋放出所有的氨基酸，然後再對釋放出來的氨基酸進行定量分析。

酸催化水解法、鹼催化水解法、酶催化水解法、

3、對角線電泳法的原理及其應用。

原理

如果兩次電泳間的特殊處理對蛋白質無影響，則電泳圖譜中的蛋白點都在對角線上；如果該特殊處理對其有影響，則電泳圖譜中的蛋白點偏離對角線。根據特殊處理的性質，可獲得變化蛋白點的相關重要信息。目前其主要作用是膜蛋白的分離鑑定，及確定二硫鍵和蛋白質複合物的研究。

應用

水解後的肽混合物進行第一相電泳，樣品點在中間，電泳畢，將樣品紙條剪下，置於裝有過甲酸的器皿中，用過甲酸蒸氣處理2小時，使-S-S-斷裂，此時含-S-S-肽段的靜電荷發生了改變。然後將紙條縫於另一張紙上，進行第二相電泳電泳，電泳條件與第一相相同，只是與第一次向成直角。在第二相電泳中，那些不含 -S-S-的電泳情況與第一相相同，因此電泳後各肽斑均坐落在紙的對角線上，而那些含-S-S-的肽由於被氧化，電荷發生變化，第二相電泳速度就與第一相不同，電泳結果這些肽斑就偏離對角線，肽斑可用茚三酮顯示。

對角線法由於其速度快，操作簡便以及能用於小分子樣品，是直接分離 -S-S-肽的好方法。含 -S-S-肽被分離後，即可進行肽段順序分析，並與已測定的該蛋白質的一級結構進行比較，即可找出相應的 -S-S-位置。

4、多肽固相合成的原理及其優點。

答：

原理

氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團保護氨基酸的共價連接在固相載體上，在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保護基，這樣第?個氨基酸連接到固相載體上了。

然後第二個氨基被封閉的氨基酸的羧基通過N,N’-二環己基碳二亞胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體的、第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重複上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要肽鏈長度。

最後脱去保護基，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的多肽。

優點

最初的反應物和產物都連接在固相載體上，因此可以在一個反應容器中進行所有的反應，便於自動化操作，加入過量的反應物，可以獲得高產率產物，同時易於將產物分離。

5、在蛋白質定性、定量分析中常用的氨基酸的理化性質有哪些，如何應用。

答：

物理性質：吸光度差異

a.近紫外吸收(280 nm)

溶液中蛋白質的含量可以利用分光光度計進行測定。蛋白質在近紫外區的吸收主要依賴蛋白質中Tyr和Trp的含量(很少的因素來自Phe和二硫鍵)。因此在不同的蛋白質中，A280值會有很大的差異。

b.遠紫外吸收

肽鍵在約190nm的遠紫外區具有很強的光吸收；

由於氧氣在該波長段的干擾以及傳統分光光度計在該波長的靈敏度低，所以測量通常選擇205nm，蛋白質在205 nm處的吸收將是在190nm處的一半；

含有不同側鏈的氨基酸，包括Trp，Phe，Tyr，His，Cys，Met，Arg的側鏈(遞減的順序)對於A205均有貢獻。 化學性質

c. Lowry法

Lowry法是以雙縮脲反應為基礎的一種方法。

蛋白質的肽鍵可以在鹼性條件下與銅作用形成絡合物，然後與Folin試劑(磷鉬酸-磷鎢酸試劑)發生反應，具體的反應機理還不清楚，大體上是由於銅催化的芳香族氨基酸的氧化作用能還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，反應最終生成具有藍色的物質，顏色的強度與蛋白質中Trp、Tyr的含量有關

法(The Bicinchoninic Acid Assay)與Lowry法非常類似，原理上也是依賴於在鹼性條件下Cu2+轉變為Cu+的反應。然後利用Cu+與BCA反應形成紫色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，並與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

e.考馬斯亮藍G-250比色法

由於G250所含的疏水基團與蛋白質的疏水微區具有親和力，通過疏水作用與蛋白質相結合。當它與蛋白質結合後形成藍色的蛋白質-染料複合物，其最大吸收波長變為595nm。這種結合在2分鐘左右達到平衡，生成的複合物在1小時內保持穩定。

f.利用微波快速蛋白質定量法

利用微波的射線可以使得蛋白質檢測實驗中的温育從標準的15～60min縮短至幾十秒。這種方法是建立在Lowry法和BCA法標準蛋白分析法的基礎上的：

當微波穿過樣品時，樣品內的分子就暴露在連續變化的電磁場中，被電離極化的分子將沿着電磁場的方向進行排列並隨着場強的變化而快速旋轉。場強越高則分子旋轉的速度越快。而微波頻率和可極化的分子大小存在着一定的關係。在常規微波爐所使用的2.45GHz下，只有小分子才會旋轉，尤其是水分子，但是蛋白質不能旋轉。

在微波爐中，樣品中水分子旋轉能的一部分會以熱能的形式釋放。由於樣品中這些小分子能夠高速旋轉，所以微波爐能夠提供非常有效的加熱，並且一般的微波產生的熱效應能引起局部温度的變化。同時還發現微波同時能夠引起蛋白質分析時反應產物形成的速率，這種加速與温度的變化無關。

6、測定蛋白質的分子量的方法有哪些？各自的原理是什麼？請通過比較説明各種方法的優缺點。

①SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

蛋白質分子狀態

在自然狀態下蛋白質通過二硫鍵聚合形成高度摺疊的生物大分子，在水溶液中，由於氨基酸殘基的解離作用使蛋白質分子形成帶有一定淨電荷的分子，在電場下向與自身電荷相反的方向移動。

還原劑的解聚作用

在蛋白溶液和分離凝膠介質中加入還原劑β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇(Dithiothretiol，DTT)。蛋白質分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚體或單鏈摺疊的蛋白質分子的二硫鍵打開，形成長短不一的單鏈亞基。

SDS的包裹作用

SDS分子中含有大量的帶負電的磺酸基。蛋白質分子解聚後形成的氨基酸側鏈與SDS結合，在SDS的重量達到蛋白重量的3-4倍時蛋白質分子表面完全被SDS包裹，形成帶負電荷的蛋白質亞基分子，稱之為蛋白質-SDS複合物(protein-SDS micelles)。由於蛋白質-SDS複合物所帶負電荷遠大於蛋白質分子自身有的淨電荷，這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質-SDS複合物在水溶液中的形狀像一個長橢圓棒。這種棒狀物的長短與亞基的分子量大小成正比。在電場下，蛋白質-SDS複合物就會向正極移動，移動的速度與蛋白質本身帶是什麼樣的電荷和帶多少電荷無關，只與橢圓棒狀的長短有關，也就是與亞基的分子量的大小有關，利用這一性質可以測定蛋白質的分子量。

聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用

不同濃度的凝膠和交聯度，形成不同大小的網狀結構，它對蛋白質-SDS複合物具有阻滯作用。在電場下，分子量大的亞基受阻大，電泳速度慢，走在小分子的後面；分子量小的亞基受阻小，電泳速度快，走在大分子的前

面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分開。

未知蛋白分子量計算：

相對遷移率mR=蛋白條帶遷移距離(cm)

染料遷移距離(cm)將未知蛋白的mR值查到log(M)值，便可知其分子量。計算分子量方法除了用標準曲線法外，還可以用比較法和機讀法。

（比較法:

用標準蛋白的相對位置與未知蛋白的位置進行比較，初步判斷。這是在發表論文時常用的表示方法。

機讀法：

用凝膠掃描儀，將凝膠圖譜掃描輸入計算機中，通過影像文件系統處理，便很快得知未知樣品的分子量。但發表論文時，仍然要注出原始圖譜，因為經計算機處理的圖譜有作假之嫌。）

優點：操作方便、分辨率高、樣品用量少、重複性好。

缺點：對電荷異常或構象異常的蛋白、帶有較大輔基的蛋白(如糖蛋白)及一些結構蛋白等測出的相對分子質量不太可靠。

②凝膠過濾層析

凝膠過濾層析(Gel filtration)，也稱為分子篩層析、凝膠排阻層析(Exclusionchromatography)。凝膠過濾層析介質是以不同濃度的凝膠交聯聚合而成的多孔徑的，網狀結構的球體。在色譜柱內不同大小凝膠的孔徑可以通過不同大小的蛋白質分子。因此，凝膠過濾層析介質對蛋白質分子具有排阻作用。在凝膠過濾層析分離的過程中，大分子先流出，小分子後流出。

標準曲線法

分子量的測定一般都採用標準曲線法。使用幾種不同分子量的混合標準蛋白，經排阻色譜進行分離會得到不同保留值的色譜峯，以分子量的對數值(lgMr)為縱座標，以收集體積(ml)為橫座標，繪製標準曲線圖。然後將未知樣的標留體積在標準曲線上查得分子量。未知蛋白分子量計算：將未知蛋白排阻層析的洗脱體積從標準曲線上查到相應的log(M)值，便可求出其分子量。

優點：不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較温和，可在相當廣的温度範圍下進行。不需要有機溶劑，並且對分離成分理化性質的保持有獨到之處，對於高分子物質有很好的分離效果。

缺點：由於凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分辨率不高，分離操作較慢。

③質譜法

質譜法是利用電磁學的原理，使帶電的樣品離子按質荷比進行分離的方法。

ZeU=mv2e=1。60×10?19 U：加速電壓 m：離子的質量Z：電荷數v：離子被加速後的運動速度

具有速度v的帶電離子進入質譜儀的電磁場中，根據所選擇的分離方式，最終實現各種離子按m/z進行分離。 優點：廣譜性檢測，幾乎能測量所有物質的成份、結構；消耗樣品少；靈敏度、分辨率、精確度都很高；方便串聯其他儀器，形成組合，提高驗證效率。

缺點：經處理後，分子無生物活性；質譜儀器昂貴，維護極難。

7、凝膠過濾和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種方法都是根據分子大小而對蛋白質進行分離的，並且都使用交聯聚合物作為支持介質，為什麼在前者是小分子比大分子更易留，而在後者則恰恰相反？

答：凝膠層析與分子篩孔隙有關，其固定相是多孔凝膠，小分子會進入凝膠內孔隙，而大分子則在凝膠間隙中流動。小分子比大分子走過的路徑長，所以小分子比大分子更易留在凝膠內。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質與陰離子表面活性劑結合，降低或者消除了蛋白質的表面電荷，使其帶負電荷，同時，在水溶液中SDS-蛋白質複合物都具有相似的結構，而分離膠中的孔徑大小一致。大分子遇到的阻力比小分子大，所以大分子比小分子更易留在凝膠內。

8、説明凝膠過濾層析的原理，它的用途有哪些，請列出3-5種？

答：

原理：

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，本身像個"篩子”，不同類型凝膠的篩孔的大小不同。當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由於它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩衝液洗脱時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先後流出凝膠柱，達到分離的目的。

用途：

脱鹽：高分子（如蛋白質、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質，可以用凝膠層析法除去。

提純：除去分子量差別較大的雜蛋白。

分離不同分子量的蛋白質：若流速恆定的條件下，其保留時間也是一定的，所以凝膠過濾層析根據蛋白質不同的分子量可得到不同的保留體積，從而分離不同分子量的蛋白質。例如，分離同一蛋白的二聚體、三聚體、多聚體等形式。

測定高分子物質的分子量：用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脱體積，並以洗脱體積對分子量的對數作圖，在一定分子量範圍內可得一直線，即分子量的標準曲線。測定未知物質的分子量時，可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗脱後，根據物質的洗脱體積，在標準曲線上查出它的分子量。

研究蛋白質配體有無相互作用：大部分的蛋白質都是和伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質形成複合物來發揮作用。以凝膠為親和層析的載體，對蛋白質-蛋白質複合物進行電泳，對比兩種蛋白質單體的條帶，可探知兩種蛋白質是否有相互作用

9、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳(IEF)的原理。

答：

（蛋白質分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關係，蛋白質是兩性電解質，在酸性溶液中成陽離子，在鹼性溶液中成陰離子，蛋白質分子所帶淨電荷為零時的pH值稱為蛋白質的等電點(pI)。）

聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，其分辨率一般達到0.01個pH值，最高可達到0.001個pH值。它是利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點的差異進行電泳分離和分析。蛋白質在一個穩定的線性pH梯度的凝膠中電泳，蛋白質朝着與自身電荷相反的方向移動，在移動的過程中不斷被凝膠中的反離子中和，最後靜電荷完全被中和而停止運動，聚焦在等電點的位置。

10、蛋白質翻譯後加工與修飾有哪些形式、各有什麼生物學意義？

答：

①N-端fMet或Met的切除：蛋白質前體蛋白質在去掉N端一部分殘基後變成有功能的蛋白質。

②二硫鍵的形成：兩個半胱氨酸硫氫基可以氧化成二硫鍵，產生mRNA中沒有相應密碼子的胱氨酸。二硫鍵的正確形成對穩定蛋白質的天然構象具有重要的作用。

③剪切：在生物中有些蛋白要經過切除才能成為有活性的成熟蛋白。

④化學修飾

1) 磷酸化

磷酸化是通過蛋白質磷酸化激酶將NTP(s)的磷酸基轉移到蛋白的特定位點上的過程。

可逆的磷酸化過程幾乎涉及所有的生理及病理過程，如細胞信號轉導腫瘤發生新陳代謝、神經活動肌肉收縮以及細胞的增殖發育和分化等。

2) 糖基化

糖基化修飾指在蛋白質肽鏈上加上短鏈的碳水化合物殘基（寡糖或聚糖）的修飾。

(O位糖基化、N位糖基化、C位甘露糖化、GPI (glycophosphatidlyinositol)錨定連接)

(O位糖基化多發生在臨近Pro的Ser或Thr殘基上，糖基化位點處的蛋白多為β構型。O位糖基化反應

發生在細胞內兩個部位，一是發生在高爾基體上，一是發生在細胞核或細胞質中。N位糖基化是在內質網上由糖基轉移酶催化，在內分泌蛋白和膜結合蛋白的Asn的氨基上結合寡糖的過程；C位甘露糖化是將一分子α-mannopyranosyl殘基通過C-C鍵連接到Ser吲哚環C-2上；GPI錨定連接指的是磷脂酰-纖維糖組在靠近蛋白C端部位結合，將蛋白連接到細胞膜上。)

糖基化是真核細胞中特有的加工，這些蛋白質常和細胞信號的識別有關，如受體蛋白等。實際上幾乎所有的分泌蛋白和膜蛋白都是被糖基化的蛋白。